·产品概述
本产品是以人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）为骨架，表面镶嵌狂犬病病毒囊膜糖蛋白（RV-G）的病毒样颗粒（Virus-like Particle，VLP）。该假病毒结构高度类似活病毒，可模拟真病毒与受体结合并诱导膜融合进入细胞的过程，具有单轮感染能 力，同时该假病毒包含绿色荧光蛋白（zsGreen）和荧光素酶（Luciferase）双报告基因核酸序列，方便对后续结果进行评估。 该产品生物安全性等级低，安全性好，操作简单。
·产品应用
1）抗狂犬病病毒中和抗体效价测试；
2）抗狂犬病病毒单克隆抗体滴度检测。
·检测原理
中和抗体可由感染病原体或接种疫苗产生，可以特异识别病毒表面的抗原位点，阻止病毒入侵细胞繁殖，保护机体免受其害，具有真正的抗病毒作用。 该狂犬病毒假病毒含有病毒的中和抗原，且具有单轮感染细胞的能力。有中和活性的样品在与假病毒作用后，会丧失感染细胞的能力。 通过Elispot读数仪扫描计数每孔的荧光斑点数，或多功能酶标仪读取每孔的荧光素酶表达量，将待测样品孔的数值与假病毒对照组的数值进行比较，可判断样品是否具有中和活性，并计算出样品的有效作用浓度。计算50%假病毒被抑制时抗体的稀释倍数的倒数即中和抗体滴度。
·应用案例
（RV假病毒感染293T细胞72 h后荧光表达）
丨实验材料
1、实验试剂
293T细胞、DMEM、胎牛血清、PBS、0.25%胰酶、血清或抗体、荧光素酶检测试剂盒
2、实验设备
生物安全柜、荧光倒置显微镜、CO2细胞培养箱、离心机、多功能酶标仪、Elispot读数仪、水浴锅、移液器（单道、多道）、电动移液器、96孔板、酶标板
丨实验流程（以血清样本为例）
孵育1h 样本 假病毒 靶细胞 37℃孵育72h看荧光情况
狂犬病毒实验流程图
丨实验步骤
1、细胞铺板
取对数生长期的 BHK-21 细胞进行胰酶消化，计数后制成 1 x105 cells/mL 细胞悬液，96 孔板每孔接种 100 µL 细胞液，置 于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中继续培养
2、血清样品准备
a） 血清样品置于56℃水浴锅中灭活30 min-1h；
b） 稀释： 使用DMEM培养基对血清样本稀释，分别进行系列梯度稀释，作为独立血清样品或单抗样品进行中和抗体检测。
3、假病毒稀释
从-80℃超低温冰箱中取出假病毒置于冰上或4℃条件下融化，待其完全融化后短暂离心，使病毒液聚集于保存管底，依据 报告中假病毒滴度和实验方案设计进行系列稀释（1TCID50=1荧光斑点）；建议96孔板每孔加入4000 TCID50假病毒液。
因假病毒对不同来源的293T细胞感染效率不同，建议正式实验前进行预实验，以确定最适病毒量
4、待测样品和假病毒稀释液预孵育
将稀释的待测样品与假病毒稀释液进行等体积混合，同时设置细胞对照（DMEM培养基，100 µL/well）、假病毒对照（假病 毒稀释液与DMEM培养基等体积混合），放入37℃、5%CO2 培养箱中孵育1h。
5、感染细胞
孵育结束后各取100 µL混合液（包括阴性、阳性对照）贴壁缓慢加入已经接种好细胞的96孔板对应孔中，贴着工作台面轻轻 划“十”字混匀，放入37℃、5%CO2 培养箱中培养72h。
6、感染检测
病毒感染细胞72 h后，取出96孔板置于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达效率，拍照记录；
检测方法一： 使用Elispot荧光斑点计数仪进行检测，计算感染抑制率（%）；
检测方法二： 孔板室温放置30min以平衡至室温，加入与待测细胞培养物等体积并平衡至室温的荧光素酶检测试剂，如96 孔培养板可吸取100µL检测试剂加入100µL待测细胞培养物中。室温放置3min使细胞充分裂解，使用酶标仪检测其发光 值，注意在20 min内完成检测。（荧光素酶检测方法仅供参考，客户可根据实际使用的荧光素酶检测试剂盒操作说明进行实 验）
7、结果判定
1）结果判断：中和抗体检测实验过程中需设置假病毒对照、细胞对照，来判定实验是否成立。
注意事项
1）因细胞水平检测受细胞类型、细胞培养状态、环境条件等影响较大，客户需要根据自身条件确定细胞量、病毒加入量等关 键实验参数；建议提前进行预实验，通过预实验计算出合适的假病毒使用浓度；
2）本产品仅供狂犬病病毒抗血清或中和抗体滴度体外检测；
3）假病毒、待测样本避免反复冻融，建议启用后依据实验需求分装储存；
4）血清梯度稀释时注意不要产生气泡；
5）所有实验操作过程均需要在生物安全柜内进行，实验过程中产生的废弃物均需进行高压灭菌处理； 假病毒为微量体积，使用前请短暂离心后再取样进行操作。
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