·产品介绍
本产品是以腺相关病毒为骨架，根据靶向需求替换不同血清型衣壳蛋白，两者结合产生的嵌合病毒。该假病毒结构仅具有单轮感染能力，可模拟野生病毒进入细胞后与抗体中和的过程，同时该假病毒包含荧光素酶（Luciferase）报告基因核酸序列，方便对后续中和实验数据整理分析。本产品安全性好，操作简单。
·产品结构示意图
·预期用途
1、抗AAV病毒血清中和抗体效价测试；
2、抗AAV病毒单克隆抗体滴度检测。
丨检测原理
中和抗体可由感染病原体或接种疫苗产生，可以特异识别病毒表面的抗原位点，阻止病毒入侵细胞繁殖，保护机体免受其害，具有真正的抗病毒作用。该AAV假病毒含有病毒的中和抗原，且具有单轮感染细胞的能力。有中和活性的样品在与假病毒作用后，会发生中和反应，降低AAV病毒感染能力，导致携带的报告基因Luciferase表达量减弱。通过多功能酶标仪读取每孔的荧光素酶表达量，将待测样品孔的数值与假病毒对照组的数值进行比较，可判断样品是否具有中和活性，并计算出样品的有效作用浓度。计算50%假病毒被抑制时抗体的稀释倍数的倒数即中和抗体滴度
（以AAV8型为例，感染293T细胞72 h后荧光素酶表达）
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丨实验材料
1、实验试剂
293T细胞、DMEM、胎牛血清、PBS、0.25%胰酶、血清或抗体、荧光素酶检测试剂盒。
2、实验设备
生物安全柜、荧光倒置显微镜、CO2 细胞培养箱、离心机、多功能酶标仪、Elispot读数仪、水浴锅、移液器（单道、多道）、电动移 液器、96孔板、酶标板。
丨实验流程（以血清样本为例）
AAV中和抗体假病毒实验流程图
丨实验步骤
1、细胞铺板
取对数生长期的 293T 细胞进行胰酶消化，计数后制成 1 x 105 cells/mL 细胞悬液，96 孔板每孔接种 100 µL 细胞液，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中继续培养；
2、血清准备
a）血清样品置于56℃水浴锅中加热30 min(建议加热，去除补体干扰)；
b） 稀释：使用DMEM培养基对血清样本分别进行系列梯度稀释，作为独立血清样品进行中和抗体检测。
3、假病毒稀释
从-80℃超低温冰箱中取出假病毒置于冰上或4℃条件下融化，待其完全融化后短暂离心，使病毒液聚集于保存管底，依据报告中假病毒滴度和实验方案设计进行系列稀释（1TCID50=1荧光斑点）；建议96孔板每孔加入0.1µL假病毒液。 因假病毒对不同来源的293T细胞感染效率不同，建议正式实验前进行预实验，以确定最适病毒量。
4、待测血清样品和假病毒稀释液预孵育
将稀释的待测血清样品与假病毒稀释液进行等体积混合，同时设置细胞对照（DMEM培养基，100 µL/well）、假病毒对照（假病毒稀释液与DMEM培养基等体积混合），放入37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h。
5、感染细胞
孵育结束后各取100 µL混合液（包括细胞对照、假病毒对照）贴壁缓慢加入已经接种好细胞的96孔板对应孔中，贴着工作台面轻轻划“十”字混匀，放入37℃、5%CO2培养箱中培养72 h。
6、感染检测
病毒感染细胞72 h后，取出96孔板置于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达效率，拍照记录； 使用Elispot荧光斑点计数仪进行检测，计算感染抑制率（%）；
7、结果判定
1）结果判断：中和抗体检测实验过程中需设置假病毒对照、细胞对照，来判定实验是否成立。
丨注意事项
1）因细胞水平检测受细胞类型、细胞培养状态、环境条件等影响较大，客户需要根据自身条件确定细胞量、病毒加入量等关键实验参数；建议提前进行预实验，通过预实验计算出合适的假病毒使用浓度；
2）本产品仅供AAV抗血清或中和抗体滴度体外检测；
3）假病毒、待测样本避免反复冻融，建议启用后依据实验需求分装储存；
4）血清梯度稀释时注意不要产生气泡；
5）所有实验操作过程均需要在生物安全柜内进行，实验过程中产生的废弃物均需进行高压灭菌处理；
6）假病毒为微量体积，使用前请短暂离心后再取样进行操作。
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