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CRISPR基因敲除细胞株筛选

CRSIPR/CAS9 基因敲除系统,对细胞进行基因敲除时,需要通过单克隆细胞的筛选获得单一遗传性装的细胞进行后续的功能学实验。

实验流程

 

实验步骤

1.  将目的细胞接种于6孔板中至70-80%融合度 ;

2.  待细胞贴壁后,加入puromycin药物进行空细胞致死最低浓度筛选,一般药物浓度梯度设置为 1ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml(终浓度)进行筛选;

3.  药物处理48h 后细胞全部死亡的最低药物浓度即后续稳定株筛选的药物使用终浓度 ;

4.  将目的细胞接种于 6孔板中,待细胞贴壁后进行慢病毒感染,感染后第二天,加入最低浓度的puromycin药物进行筛选,同时做一份空细胞作为对照。显微镜下观察存活细胞中示踪基因的表达(puromycin或GFP),继续维持培养;

5. 待细胞密度生长至90%时,常规消化后接种于96孔板中,调整接种的细胞密度为1-1.5个/孔 ;

6.  继续培养两周左右,期间适时补液或换液,待孔板中细胞长至细胞克隆时,挑取阳性细胞克隆至24孔板中扩大培养并检测目的基因的表达(或敲除);

7. 正确克隆进一步的扩大培养,直至获得需要的细胞量。

 

实验结果

靶点基因组扩增后测序,核酸序列峰图单一。

 

 

单克隆细胞蛋白表达检测

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