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CRISPR-CAS9

Crispr/cas9技术,是近年来出现的高效的基因组定点编辑技术,主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成,其特点是制作简单、成本低、作用高效。

工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成 tracrRNA/ crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链 DNA,从而实现对基因组DNA序列进行编辑,而通过人工设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA),足以引导Cas9对DNA的定点切割,是目前被认为最有效的基因改造工具和极有可能想临床用的基因治疗技术之一。 

CRISPR/Cas9作用原理示意图:

 

 

 

服务流程:

 

 

相关实验产品:

1. CRISPR/Cas9克隆构建

2. CRISPR/Cas9慢病毒包装

3. CRISPR/Cas9基因敲除单克隆细胞筛选

4. SgRNA文库构建

5. CRISPR/Cas9基因敲除检测试剂盒

实验流程示意图

 

该技术相关名词解释

crRNA:CRISPR RNA能够与tracrRNA配对,形成双链RNA结构,这种双链RNA分子能够介导Cas9核酸内切酶对与双链RNA分子互补结合的DNA序列进行切割。 

tracrRNA:反式激活嵌合RNA(trans-activating chimeric RNA),这是一种非编码RNA,能够促进 crRNA的形成,也是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA切割作用必不可少的辅助因子

DSB:ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9系统对 DNA双链进行切割之后就会形成DNA双链断裂缺口(double-strand breaks),即DSB。 

HDR:同源重组修复,DSB出现之后,细胞会启动这种修复机制,以同源链为模板,对DSB进行修复。由于这种修复作用是以同源链为模板,而且还有位点特异性的核酸酶(site-specific nuclease)参与,所以其保真度非常高。利用HDR可以插入一个或者多个基因,也可以进行单碱基替换。 

NHEJ:非同源末端连接修复机制是另外一种DSB修复机制,通过这种修复可以将断裂的DSB末端直接连接起来。由于在这种修复过程中不会用到同源模板链,所以在断裂处容易出现小的插入或者缺失突变,常常会导致移码突变,使基因的功能遭到破坏。 

PAM:前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif),这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序,可以被Cas9蛋白特异性识别并切割。 

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